蛋白质作为生命功能的主要执行物质，其功能研究一直备受青睐，而蛋白质翻译后修饰作为调节蛋白质生物学功能的关键步骤之一，也成为了众多科研人的聚焦点。

 近年，泛素化相关文章发表量逐年上升。今天我们就给大家介绍一下泛素化的基本概念，并结合案例分享研究思路，最后给大家简单介绍一下相关的实验技能。

一、什么是泛素化

泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种形式，其过程包括蛋白酶体的蛋白质降解、细胞周期进程、转录调控、DNA修复和信号转导。泛素通过其C末端与赖氨酸的ε-氨基共价连接，或（较少）与蛋白质的N末端形成肽键。

泛素化的发生需要以下三种酶的连续作用：

1.泛素激活酶（E1）催化泛素的ATP依赖性活化，并在泛素C末端和半胱氨酸之间形成硫酯键；

2.泛素被转移到泛素缀合酶（E2s）催化的半胱氨酸中；

3.最后，泛素通过泛素连接酶（E3）转移到底物上。

其中，E3是泛素化途径中最异质的一类酶，它们介导的底物具有特异性。目前，根据特征结构域的存在和泛素转移到底物蛋白的机制，可以将E3连接酶分为三种类型：

类型1：RING E3s

这是最丰富的一类泛素连接酶，它们拥有一个锌结合结构域，或是一个U-box结构域，该结构域具有相同的环褶皱，但不含锌。环和U-box结构域负责结合E2和刺激泛素转移。

类型2：HECT E3s

HECT与E6AP羧基末端同源，其结构域家族的E3连接酶通过2步反应催化，转移到底物蛋白：首先将泛素转移至E3上的催化半胱氨酸，然后从E3转移到底物。

类型3：RBR E3s

与HECT E3s类似，RBR E3连接酶通过2步反应催化转移到底物蛋白：首先将泛素转移至E3上的催化半胱氨酸，然后从E3转移到底物。

RBR E3连接酶包含特定于每个成员的额外结构域，结构域参与分子内相互作用，使蛋白质处于自身抑制状态。而这种状态可以通过各种机制释放，如磷酸化或蛋白质-蛋白质相互作用。

在对泛素化有了一定的了解后，接下来就和我们一起结合高分文章，学习如何将泛素化结合到我们的研究当中。

二、案例分析

本文作者主要研究泛素化在自噬中与DDR信号串扰之间的相互作用。

IR治疗可以激活许多肿瘤自噬，而组蛋白H2A和H2AFX/H2AX响应的DNA DSBs泛素化是一种关键的翻译后修饰，具有介导下游信号传导，DNA修复因子募集的作用。因此，作者认为泛素化和去泛素化信号可以有效动态调节DDR。

1、前列腺癌细胞中自噬抑制能诱导DNA损伤

2、USP14破坏自噬缺陷细胞中的DDR信号传导

3、SQSTM1与USP14结合且调节其水平

4、USP14是自噬底物

5、USP14介导RNF168泛素化

6、USP14调节RNF189的泛素化来影响其蛋白水平

三、相关实验技能

蛋白泛素化检测（IP-WB法）：IP-WB法通过免疫共沉淀将目标蛋白与其结合的蛋白分离，将分离的蛋白再进行SDS电泳和Western Blot检测。

具体步骤：

（1）将目标蛋白真核表达载体和带HA tag的泛素载体共转染细胞（可以是所研究的细胞，也可以用工具细胞293T）

（2）24小时后加入20µM蛋白酶体抑制剂（MG-132），孵育4小时后收取细胞

（3）加入预冷的细胞裂解液（使用前加入PMSF和磷酸酶抑制剂），于冰上裂解30min

（4）4℃，12000转离心20min，提取上清蛋白至新的EP管中，加入1µg目标蛋白抗体，4℃缓慢摇至过夜

（5）加入20µl的Protein AG beads，继续4℃缓慢摇转4小时

（6）4℃，2500转离心5min，小心吸除上清，沉淀中加入1mlPBS洗涤，洗涤后，4℃，2500转离心5min，洗涤步骤重复3-5遍

（7）沉淀中20µl 1xSDS PAGE电泳上样缓冲液，Vortex轻微震荡重悬沉淀

（8）4℃瞬时高速离心将样品离心至管底，与沸水中煮沸10min

（9）上清进SDS PAGE电泳，用Western Blot检测泛素化情况（用HA标签抗体）

以上就是本篇文章的全部内容~

文章出自：细胞实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/